REM Technik - Dr. Jastrows EM Atlas

Vokabular
mikros-
kopische
Anatomie
Fachtermini
Deutsch
+ Englisch
erklärt

Alle publizierten Inhalte wurden eingehend geprüft, dennoch wird keine Haftung für Richtigkeit und Vollständigkeit der Angaben übernommen!

of this page

Editor:
Dr. med.
H. Jastrow

Nutzungs-
bedingungen

Herstellung von Präparaten für die Transmissionselektronenmikroskopie
Vorbemerkungen:
Die hier vorgestellte Methode ist als Beispiel für Fixierung, Kontrastierung und Einbettung zu sehen. Sie eignet sich gut für die Netzhaut (Retina) und die Zirbeldrüse.
Zur Erzielung optimaler Ergebnisse sollte insbesondere die Fixierung dem jeweiligen Gewebe angepaßt werden.
Wichtig ist vor Allem, daß das Fixativ schnell das gesamte Gewebe durchdringt. Falls keine Perfusionsfixierung (Einbringen des Fixativs in das Gefäßsystem des betäubten Tieres) erfolgt, sollten deshalb nur sehr kleine Gewebsstücke (ca. 1 mm³) verwendet werden.
Das Präparat sollte so schnell wie möglich entnommen und fixiert werden, denn schon nach 5 Minuten treten erste Degenerationsartefakte auf.

Methodik:
- Perfusions- oder Immersionsfixation des Gewebes mit einer Lösung nach Karnovsky (1965):
Lösung aus 2,5 %igem gepuffertem Glutaraldehyd + 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (Sörensenpuffer) pH 7,4
- Gewebe über Nacht bei 4° C darin belassen
- Auswaschen 3 x 15 Minuten in 0,1 M Na-Phosphatpuffer mit 0,1 M Saccharose
- Nachfixierung 90 Minuten in 2 %igen Na-Phosphat-gepuffertem Osmiumtetroxid pH 7,4
- Auswaschen 3 x 15 Minuten im 0,1 M Na-Phosphatpuffer pH 7,4
- Entwässerung 2 x 15 Minuten 50 % Aceton (in destilliertem Wasser)
- Kontrastierung über Nacht mit 70 % Aceton + 0,5 % Uranylacetat + 1 % Phosphowolframsäure bei 4° C
- 2 x 15 Minuten 80 % Aceton
- 2 x 15 Minuten 90 % Aceton
- 2 x 15 Minuten 96 % Aceton
- 3 x 20 Minuten 100 % Aceton
- 2 x 15 Minuten Propylenoxyd
- 30 Minuten 2 : 1 Propylenoxyd : Epon Mischung
- 30 Minuten 1 : 1 Propylenoxyd : Epon Mischung
- 30 Minuten 1 : 2 Propylenoxyd : Epon Mischung
- Eponlösung über Nacht bei 4° C
- Ausbettung in frische Eponlösung
- ca. 48 Stunden bei 65° C im Brutschrank polymerisieren lassen
- Schneiden mit dem Ultramikrotom Schnittdicke 50 - 100 nm
- Aufbringen der Schnitte auf Gitternetze oder mit einer speziellen Gelatine überzogene Einlochnetze aus Kupfer oder Nickel
- Nachkontrastierung der Schnitte nach Reynolds (1963):
- 10 Minuten 8 % Uranylacetat
- 5 Minuten 0,7 % Bleicitrat + 0,9 % Natriumcitrat
- Nach Trocknung können die Schnitte im Transmissionselektronenmikroskop untersucht werden

Literatur:
Reynolds, E.S., 1963. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol. 17, 208-212.
Karnovsky, M.J., 1965. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J. Cell Biol. 27, 137-138.

--> Elektronenmikroskopischer Atlas Gesamtübersicht
--> Homepage des Workshops